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寡核苷酸药物有着靶点丰富，研发周期短，药效持久，特异性强，临床开发成功率高等优势，具有广阔的市场前景。然而寡核苷酸药物的广泛应用，仍面临着诸多挑战，如递送问题，脱靶以及产生毒副作用的风险，使得寡核苷酸药物的研发任重道远。
寡核苷酸药物(oligonucleotides, ONs)由化学合成的12～30 个短链RNA或DNA组成，可通过 Watson-Crick 碱基配对原则，与目标RNA结合，利用内源性核酸酶降解目标RNA或通过立体阻断核糖体机制调节RNA 剪接和翻译过程，从而达到治疗疾病目的。寡核苷酸药物主要分为反义寡核苷酸药物(antisense oligonucleotides, ASOs) 、小干扰RNA 药物(small interference RNA, siRNA)、核酸适配体(apatmers)以及小激活RNA（small activating RNA, saRNA）等类。目前已上市在临床得到验证的寡核苷酸药物集中在ASOs和siRNA两类，它们的作用机制，优势和局限如图1所示，它们在不同领域都有各自潜在的应用场景。
截至目前，已有9款ASO药物和5款siRNA药物上市，ASO和siRNA药物开发主要围绕提高活性和降低毒性展开。如图2所示，从药物设计角度来讲，寡核苷酸药物是基于与疾病相关基因进行序列配对发挥作用，因此在设计流程上更明确，更有针对性，获得疾病相关基因序列后可进行程序化设计。目前siRNA的设计经验相对丰富，而ASO设计的效率较低，通常需要设计更多化合物满足需求，因此尚需迭代新技术以提高设计效率。药物开发上更大的挑战在于递送和毒性两方面。递送方面，寡核苷酸药物的挑战主要是ONs易被核酸酶降解，肝肾快速清除，导致靶器官浓度低，迫使给药剂量提高；另外ONs的组织和细胞穿透性差，自身分子量和负电荷导致其不能自由通过生物膜；即使进入细胞后，也可能因“卡”在内吞小体中无法发挥功能。ONs的毒性挑战分为在靶毒性和脱靶毒性，脱靶毒性主要由于个别核苷酸错配导致。
为解决这些问题，过去几十年，医药研发企业和科学家们做了大量的工作。通过改造核酸分子，优化递送系统解决了一系列的挑战，降低了寡核苷酸药物免疫原性，提升递送效率，并使ONs在临床上得到应用。
核酸修饰需要考虑多方面，既要增强稳定性，降低免疫原性，还要保持碱基亲和配对能力以及和相关蛋白结合的能力，确保药物活性。第一代的针对基础骨架的结构改造是磷硫(PS)修饰，通过减少ONs的亲水性，增加对核酸酶降解的抵抗力，增加其与血浆蛋白结合，大大改善了药代动力学性质，提高了ONs的稳定性。但是这种修饰降低了ONs和靶标的亲和力，需要大剂量反复给药，造成很大的毒性；二代寡核苷酸是在PS骨架修饰的基础上将2ʹ-羟基(2ʹ-OH) 替换成2ʹ-甲氧基(2ʹ-O-Me)、2ʹ-甲氧乙氧基(2ʹ-MOE)、2ʹ- 氟(2ʹ-F)等结构，增强稳定性和靶标结合亲和力，同时降低免疫刺激性。后续又产生了第三代糖环结构改造，锁核酸（locked nucleic acid, LNA）、肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）等技术，提高ONs的稳定性和亲和力。
前述化学修饰是针对单个核苷酸，对于多个核酸组合而成的高分子核酸药物，需要考虑改造数量和组合，反复测试，以达到整体合理。如14个以上PS修饰才可以保证ONs与血浆蛋白的结合。siRNA先锋企业Alnylam发明了STC（standard template chemistry，标准模板化学）与ESC（enhanced stabilization chemistry，增强的稳定化化学）修饰模式，也可供参考。所谓STC原则，即在反义链的5’端第11-13 BP位置以3个连续的甲氧基修饰；ESC原则，即将反义链增长为23个核苷酸，用PS修饰替换正义与反义链的5’端前两个磷酸键，采用甲氧基修饰核糖代替。当然每个核酸分子有特定的序列，并不一定完全适应修饰模板，需要实际情况具体测试。
单纯通过化学修饰还是很难使寡核苷酸药物到达靶部位，好的递送系统是解决研发瓶颈的重中之重。目前临床上应用的是脂质纳米粒（lipid nanoparticles , LNP）递送系统和 N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）递送系统。LNP含有阳离子化脂质，可提高跨膜效率，应用广泛，然而LNP制剂常常引起促炎症反应造成机体损伤；作为后起之秀的GalNAc递送系统递送效率高，潜在毒性较小。GalNAc是去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）的靶向性配体，ASGPR是一种内吞性受体，在肝细胞的膜表面上高特异性地表达，这也决定了GalNAc递送系统仅在肝脏细胞发挥作用。肝外递送系统还需要探索，随着递送技术的不断升级，相信小核酸药物的应用版图会进一步扩大。
寡核苷酸药物的研发流程如图6所示。首先是确定靶点并加以验证：通过疾病机制挖掘靶点，或借助人类遗传学和AI技术挖掘新靶点，明确靶点后，建立相应的筛选方法；随后是对核苷酸药物序列、修饰及递送技术筛选。需要注意，由于寡核苷酸是基于序列设计的药物，建议早期便引入脱靶效应研究。随后进行体外自由摄取和稳定性相关研究，后期再针对寡核苷酸的药代动力学性质和毒性进行药物优化。
具体而言，1. 在序列设计方面，需对靶点进行深入了解，包括表达模式，靶点异构体和SNP数据搜集；2. 需考虑不同种属之间序列差异，设计序列至少覆盖人和猴的种属，如果能覆盖小鼠最优，否则药效试验需要在人源化基因小鼠模型进行，增加了试验难度和成本；3. 需考虑整体脱靶效应，并借助热动学以及序列特征进行活性预测。
体外活性筛选主要关注点是靶基因表达量，大多数情况可通过RT-PCR进行早期筛选，检测mRNA表达情况。然而有些靶点在细胞系中表达水平较低，尤其是一些疾病突变基因，正常细胞系的表达量极低，可构建稳转细胞系或瞬转报告基因系统进行筛选。
在进行序列活性筛选以后，可进行化学修饰的研究，旨在增强活性。小核酸药物碱基修饰虽然不广泛，但在特定位置的碱基修饰也是可以进行探索的。如下图所示，文献报道采用CADD的方法筛选反义链5‘端碱基修饰，这个位置影响siRNA与RISC Ago2蛋白的结合，对配对影响不大，通过筛选得到了活性提升的分子。
化学修饰另一个作用是提升化合物的稳定性，改善药代动力学性质。体外核酸酶或血清稳定性是常见的试验研究，进一步定量研究稳定性可以选择肝匀浆进行稳定性测试，因为小核酸药物代谢通过核酸酶完成，肝匀浆稳定性与体内代谢以及体内基因敲低活性结果相关性更好，而且研究表明肝匀浆在不同种属间相关性也比较好，所以可以采用小鼠肝匀浆稳定性研究作为主要的体外稳定性评价方法。
化学修饰的第三个目的是降低免疫毒性，核酸分子的免疫毒性主要来源是天然免疫系统中模式识别受体（pattern recognition receptor, PRR）激活引发的机体免疫反应。体外毒性研究可以通过报告基因试验，检测核酸分子对不同免疫通路的影响，或检测下游细胞因子和免疫细胞的改变，另外针对能够激活补体系统的核酸分子进行补体激活试验要考虑种属差异。
关于递送系统活性评价，如图9所示。可以通过SPR技术检测递送系统和受体结合能力，或进行细胞水平试验，借助荧光标记，计算EC50，快速方便评价递送系统。
递送系统和序列综合评价可以进行自由摄取试验（图10），借助自身递送系统进入细胞，检测靶蛋白表达量，观察递送效率和分子本身活性。
体内药物分布和药代动力学相关研究，通过血浆和各种组织中药物浓度的测试，来评价体内递送的效率和特异性。除此之外可以进一步检测沉默复合物(RISC)中siRNA浓度，因为RISC siRNA浓度和药效相关性更加密切，相关性更好。另外新的化学修饰需要保持和Ago2等蛋白的结合能力，在机理研究方面也会考虑体内或体外试验检测是否能够和RISC结合，从而指导化学修饰的优化（图11）。
即使在设计时考虑序列特异性，但是很多靶点的种属差异比较大，难以保证设计序列可以直接用正常小鼠进行实验，因此需要用到“人源化” 小鼠模型。针对肝靶点可以采用高压尾静脉注射小鼠模型 ((Hydrodynamic injection, HDI)，腺相关病毒（Adeno-associated Virus ,AAV）, 转基因动物人源化模型，它们各有适用的试验场景，可根据靶点，项目阶段具体情况进行选择。肝外靶点可以考虑AAV和转基因动物模型，转基因动物模型效果较好，但是制备时间长；AAV造模快，但是基因载体有限。此外，小鼠体内验证完成后，小核酸药物通常还需要在猴子体内进行活性验证。
关于脱靶效应研究，不同阶段有不同的研究策略（图12）。包括：1. 序列初筛后，借助计算机进行初步序列分析；2. 得到体内试验数据，分析获得活性较好的化合物以后，进行RNA-seq研究，在差异基因中寻找潜在脱靶基因；3. 在psiCheck 报告基因系统可模拟脱靶序列进行脱靶评价，在早期化学修饰阶段采用此系统快速有效。
寡核苷酸药物相比小分子和抗体药物，具有以下优势：
靶点丰富，靶向特异性强，药物作用长效，如siRNA药物进入细胞后产生的RISC复合体可以循环工作；
针对序列的数字化药物设计更方便；
生产快速，化学合成进行生产，不需要用到细胞和酶等变量较多的生物系统，生产工艺相对抗体药物简单等诸多优势。
随着递送系统和化学修饰等技术发展，寡核苷酸药物的临床应用范围会越来越广。
寡核苷酸药物今后研究方向包括但不限于：1. 基于现阶段靶向肝器官递送，开展疾病生物学研究以挖掘更多的肝脏靶点；2. 开发针对肝外器官的高效递送技术；3. 加强研究内体逃逸的机制，提高逃逸效率，减少毒副作用；4. 化学修饰研究，突破技术瓶颈，提高药效和降低毒性。
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