近日，药明康德HitS事业部在SLAS上发表了针对冠状病毒主蛋白酶（SARS-CoV-2 Mpro）的筛选新发现：通过其自主设计与构建的共价DNA编码化合物库，快速在18亿个小分子化合物中筛选出与靶蛋白1:1共价结合的新型共价抑制剂，有望成为研究新型冠状病毒的辅助小分子。

一：亮点速递

18亿共价化合物库：基于药明康德数万试剂底物，连接与半胱氨酸反应的共价亲电试剂，通过3-4轮的化学反应，构建了18亿的共价化合物库。

筛选方法最优解：本次研究对比了“咪唑竞争法”和“磁珠加热法”，最终选择了“咪唑竞争法”作为本次亲和筛选的最优方法，并确定库浓度、靶蛋白量、孵育温度和时间等最优条件。

两类Hit：本次研究发现了两类结构新颖、与SARS-Cov2Mpro共价结合的小分子化合物，它们的抑制作用、共价结合性质和初步构效关系均已确定。

二：难点梳理

考虑到共价相互作用的特殊性和DEL筛选的一般流程，想要成功的运用共价DEL筛选技术，需要克服以下几个难点：

1. 专属的共价DNA编码化合物库

迄今为止，开发新型共价抑制剂的主要挑战是缺乏可用于高通量筛选的共价化合物库。为了解决这一问题，药物研究人员通常的策略是在已知非共价结合剂中直接设计添加或改造形成亲电性共价弹头。然而，这一策略存在时间跨度长和缺乏进行高通量筛选的广泛化学多样性集合的缺点。

DEL技术可以使得大量带有共价反应基团的化合物得以在短时间内完成构建，但在建库的过程中需要确保和检测共价反应基团的反应活性，进而保证共价化合物库的质量。药明康德在这方面完成了阶段性探索，形成了完整的质量检测和反馈体系。

2. 专属的DEL筛选方法

不同于非共价筛选所采用的亲和筛选，一次筛选后共价分子与蛋白即形成共价键，不会再完成第二次筛选。因此。如何利用共价结合的反应特点，探索不同“蛋白质靶标+亲电性共价弹头”各种筛选组合的最佳条件，提高一轮亲和筛选的信噪比，是筛选过程中的最大难点。

3. 假阳性的识别

共价筛选过程只包含一次筛选，信噪比较非共价筛选更小，如何区别有效信号，并排除非特异性共价反应分子是共价筛选技术成功与否的关键。

三：研究解读

背景介绍

SARS-CoV-2是导致COVID-19全球爆发的一种单链RNA病毒，而SARS-CoV-2主蛋白酶在其感染和生命周期中起着至关重要的作用。结构分析表明，SARS-CoV-2 主蛋白酶与其它冠状病毒的主蛋白酶结构类似，且没有人类主蛋白酶同源物，是理想的抗病毒药物靶标之一。

目前多数报道的SARS-CoV-2 主蛋白酶抑制剂多数为共价抑制剂，通过与关键氨基酸残基Cys145的不可逆或可逆共价结合达到抑制其活性的目的。一般认为，共价分子与蛋白靶点相互结合分为两个步骤，第一步分子可逆结合蛋白口袋，第二步与临近的氨基酸残基形成共价结合从而使蛋白靶点失活。

图1：SARS-CoV-2主蛋白酶靶点的介绍

研究思路

药明康德HitS平台通过以下技术路线，解决了部分上述问题，获得了两类结构新颖的SARS-Cov2 Mpro的共价结合的小分子化合物，并确定了小分子化合物的抑制作用、共价结合性质和初步的构效关系，同时通过分子模拟分析了Hit和蛋白酶的结合模式，为进一步优化提供了可能。

图2：研究流程图

实验步骤

1. 共价DEL的构建

DEL库的构建遵循“split & pool”原理，共价DEL库基于药明康德化学砌块丰富的非共价中间体库，同时结合蛋白半胱氨酸的特性，在测试了不同共价亲电基团在DNA兼容反应条件下的稳定性后，选择合适的亲电性共价弹头和中间体库进行连接，快速构建了18亿的共价化合物库，大大扩充了共价DEL的化学多样性。

图3：具有特定化学结构特征的共价DEL库富集分子的立方分析图（每个轴代表一个化学循环的合成砌块，每个点的大小与特定化合物的拷贝数成正比）

2. 共价DEL亲和筛选

研究人员对共价DEL筛选过程进行了优化，包括孵育时间、共价DEL和靶蛋白的使用量。本次试验采取了“咪唑竞争法”，最终选定10 pmol 共价DEL，5 μg SARS-CoV-2 Mpro，室温下孵育1小时为最优条件。研究人员将带His标签的靶蛋白与DEL库共孵育后，经过靶蛋白固载，冲洗去除不结合靶蛋白的DEL分子，再添加咪唑进行竞争性洗脱，收集和纯化洗脱液后，经PCR扩增和NGS测序，研究人员得到此次筛选的数据集，并通过DNA解码获得富集分子的结构信息，进一步的结构聚类分析发现了两类具有结构特征的系列化合物。

研究人员同时尝试了另一种常规洗脱方法——“磁珠加热法”，即采用热洗脱法来处理孵育后的样品，加热至95℃使蛋白质变性，靶蛋白和未共价结合的小分子彼此分离，收集热洗脱后依旧留在磁珠（靶蛋白）上的化合物，直接带着磁珠进行PCR扩增，再进行序列测定。筛选的富集信号显示，磁珠加热法未发现明显的结构特征，表明优化的咪唑竞争性洗脱方式可能导致了更低的背景信号和更高的信噪比。

同时，研究人员对比了共价DEL选择的孵育时间分别为1小时和16小时的信号，发现随着时间的增加，背景信号随之增多，从而降低了靶蛋白的信噪比。需要注意的是，针对不同的靶蛋白的共价筛选均需要优化其共价筛选条件，这取决于不同靶蛋白形成共价键的亲核性氨基酸残基和期望的hit之间的命中效率。

3. On-DNA化合物验证

研究人员按DEL合成步骤，重合成了带有DNA标签的小分子化合物，并通过LC-MS分析此次合成的反应混合物（包含合成的起始原料，反应副产物，中间产物及终产物）。通过荧光染色试验确定这些产物的共价结合性质，并对有结合活性的分子进行off-DNA合成。

图4：重合成小分子list

4. Off-DNA的共价结合验证

借助完整的MS分析，确定了小分子抑制剂和蛋白的共价结合性质；LC-MS测试证明抑制剂随着孵育时间增加而增加；细胞裂解液存在下共价结合的荧光染色分析表明抑制剂对SARS-CoV-2Mpro具有一定的选择性。

图5：MS分析共价结合性质

5. 病毒Mpro酶活抑制测试

研究人员测试了小分子化合物不同冠状病毒（SARS-2, SARS-1, OC43,MERS, 229E, HKU1和 NL63 CoV）Mpro的抑制活性，其中化合物1e对SARS-CoV-2 Mpro的IC₅₀值最低，达到个位数μM级。

图6：小分子化合物针对不同冠状病毒Mpro的抑制活性结果

此外，化合物1e对SARS-CoV-2 Mpro在1小时和16小时的抑制活性测试表明，随着孵育时间的增加，共价反应的IC₅₀降低，这与共价反应的时间依赖性一致。

图7：化合物1e对SARS-CoV-2 Mpro抑制活性测试

6. 抗病毒活性测试

参考报道的共给药P-gly转运抑制剂可以减少细胞外泄的抗病毒试验策略，在2 μM CP-100356存在的情况下，测试了化合物1e对SARS-CoV-2感染的细胞的抑制作用及对细胞活力的影响。其EC₅₀值为33 μM, CC₅₀值大于100 μM。

图8：化合物1e对SARS-CoV-2感染的细胞的抑制作用及对细胞活力的影响

7. 分子模拟

研究人员通过对化合物1e和2a进行分子模拟分析，显示了两个小分子化合物和SARS-CoV-2 Mpro的活性口袋的结合模式，为进一步的hit-to-lead优化以获得更高活性的潜在药物分子提供了助力。

图9：化合物与靶点的共价对接模式

总结：本研究利用药明康德自主设计构建的共价DEL，开发的优化后的共价筛选方法，快速得到新型SARS-CoV-2 Mpro共价抑制剂，这一高效有效的共价DEL筛选方式对于共价Hit发现具有重要意义。